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Introduzione: Data la grave carenza di organi necessari per i trapianti, il trapianto di organi non umani nell'uomo (xenotrapianto) offre una potenziale fonte alternativa, come nel caso del pancreas/isole di Langerhans o rene per il paziente diabetico. Alcuni organi del maiale hanno dimensioni e funzioni simili a quelle dell'uomo. Il loro utilizzo è al momento limitato dal fatto che il genoma dei maiali contiene retrovirus endogeni di suino (PERV) che possono potenzialmente passare agli esseri umani con possibili conseguenze dannose.
Obiettivo dello studio: Generazione di cellule di maiale primarie che non contengano retrovirus endogeni di suino (PERV) attivi e che possano essere utilizzate per clonare animali “PERV free” utilizzabili per lo xenotrapianto
Metodiche: L’editing genico è stato condotto con la metodica del CRISPR-Cas9, il clonaggio dei maiali è stato eseguito con la tecnica del trasferimento nucleare
Risultati: I risultati primari dello studio sono stati:
a)    La conferma che i retrovirus endogeni di suino sono effettivamente in grado di infettare le cellule umane e di integrarsi nel genoma umano con anche la possibilità di una trasmissione orizzontale tra cellule umane.
b)    La creazione di una linea primaria di fibroblasti fetali suini in cui le 25 copie di retrovirus endogeni di suino presenti sono state inattivate. A questo scopo sono stati utilizzati due RNA CRISPR (gRNA) specifici per il nucleo catalitico del gene PERV pol
c)    Con la creazione della linea primaria è stato possibile produrre embrioni, feti e animali adulti PERV inattivati. La produzione di maiali PERV inattivata è risultata robusta e consistente in quanto, fino ad oggi, gli autori hanno prodotto 37 porcellini PERV inattivati da 17 scrofe (200-300 embrioni trasferiti per scrofa), di cui 15 vivi con una età massima al momento di 4 mesi. Gli studi a lungo termine per per monitorare l'effetto dell'inattivazione PERV e dell'editing genetico sono in corso
Conclusioni: E possibile generare maiali che non contengano retrovirus endogeni attivi, un passo rilevante nella possibilità di utilizzare xenotrapianti nella pratica clinica.
Commento: La mancanza di organi umani utilizzabili per il trapianto rimane un problema drammatico: negli Stati Uniti, 22 persone al giorno muoiono in lista di attesa per la mancanza di una donazione compatibile. Gli organi di maiale possono essere una opzione alternativa in quanto possono crescere ad una dimensione compatibile con l’utilizzo nell’uomo. Uno degli ostacoli a questa opzione è stata la scoperta che nel genoma del maiale sono presenti retrovirus endogeni, denominati PERV,  in grado di infettare le cellule umane in vitro. In passato impianti di isole di maiale in persone con diabete sono stati effettuati senza evidenza di successiva infezione da PERV. Ma questi impianti erano costituiti da un piccolo numero di cellule all'interno di una capsula protettiva in assenza di terapia immunosoppressiva. La possibilità di utilizzare organi più grossi in contesti clinici che richiedono farmaci immunosoppressivi rappresenta un rischio maggiore per la trasmissione di PERV. Per questo motivo la creazione di animali “PERV free” costituisce una condizione sine qua non per procedere nell’utilizzo dello xenotrapianto. L’avanzamento delle conoscenze di editing genico mediante la metodica del CRISPR-Cas9 ha aperto questa possibilità. I genetisti della Harvard University George Church e Luhan Yang (ultimo nome del presente lavoro e tra i primi a sviluppare questa tecnologia di gene-editing) hanno fondato nel 2015 eGenesis, una company finalizzata alla ingegnerizzazione degli organi di maiale per il  trapianto. Nel 2015 il gruppo aveva già dimostrato la possibilità di eliminare i geni PERV in tutti i 62 siti del genoma suino mediante CRISPR-Cas9. Ma per quel progetto, avevano usato una linea di cellule renali immortalizzate, scelte per la loro capacità di sopravvivere e dividere indefinitamente in vitro. Per creare maiali “PERV free”, era necessario iniziare con cellule geneticamente normali direttamente ottenute da un maiale vivente. In questo lavoro, fatto con un team di collaboratori danesi e cinesi, il team eGenesis ha applicato il sistema CRISPR-Cas9 a cellule derivate dal tessuto connettivo di suini fetali e introducendo modifiche del precedente protocollo ha ottenuto cellule senza PERV al 100% in vivo. Avendo a disposizione queste cellule è stato possibile produrre con una tecnica di clonazione standard embrioni che impiantati nell'utero di una madre surrogata hanno dato vita ad animali vitali PERV free. Prima di questo studio c'era un'enorme incertezza scientifica sul fatto che un embrione così manipolato potesse dare vita ad una animale vitale.
Il risultato dimostrata quanto sicura ed efficiente è oramai la nostra capacità di modificare il DNA di esseri viventi di grandi dimensioni. I PERV non erano l'unico punto irrisolto dello xenostrapianto. Ora si dovrà procedere ad eliminare i geni che attivano il sistema immunitario umano e inserire altri che impediscano interazioni con il sangue umano. Ma ora il traguardo è molto più vicino.

A cura di Lorenzo Piemonti e Margherita Occhipinti

Niu D, Wei HJ, Lin L, George H, Wang T, Lee IH, Zhao HY, Wang Y, Kan Y, Shrock E, Lesha E, Wang G, Luo Y, Qing Y, Jiao D, Zhao H, Zhou X, Wang S, Wei H, Güell M, Church GM, Yang L. Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9. Science. 2017 Sep 22;357(6357):1303-1307. doi: 10.1126/science.aan4187. Epub 2017 Aug 10. PubMed PMID: 28798043